第423章 成功

    多顺反子能和核糖体小亚基上的16srrna的3端富含嘧啶核苷酸的区域配对结合，有助于带有甲酰甲硫氨酸的起始trna识别mrna上的起始密码(aug)，使肽链合成从此开始。这段顺序是1974年由j.夏因和l.达尔加诺发现的，所以称为sd顺序，也称核糖体结合部位。原核生物mrna的编码区一般编码几种功能上相关联的蛋白质，两种蛋白质的编码区之间常有一小段不翻译的顺序，叫做间隔区。

    有的噬菌体rna中2个相邻的顺反子共用一段相同的编码顺序，例如，m噬菌体rna中的溶菌蛋白编码区共225个核苷酸中有189个核苷酸是由相邻两个蛋白质共用的。原核mrna与真核mrna一样使用同一套三联体密码子(真核生物线粒体mrna有例外)。原核生物合成氨基酸的cao纵子mrna的5端前导顺序上有一段顺序称作弱化子。弱化子具有两种可以互变的构象，其中一种构象是转录终止的信号，能使转录中止(或衰减)。衰减调节是原核生物合成氨基酸的调控方式之一。

    真核生物mrna(细胞质中的)一般由5端帽子结构5端不翻译区翻译区(编码区多顺反子

    多顺反子)3端不翻译区和3端聚腺苷酸尾巴构成。分子中除g构成帽子外，常含有其他修饰核苷酸，如a等。5端帽子结构通常有3种类型，即:g(5)ppp(5)n;g(5)ppp(5)n和g(5)ppp(5)n。图1b[真核生物mrna结构示意图b5端帽子结构式，表示碱基，表示碱基是帽子的化学结构，n右边的m代表核糖2位羟基的甲基化。真核细胞线粒体中的mrna无帽子结构。一般认为帽子的功能与翻译的启动有关。许多真核生物mrna(如珠蛋白mrna)除去帽子后翻译效率大大降低。5端不翻译区。也叫前导顺序。不同的真核mrna的前导顺序长度不同，有的只有10个核苷酸，有的则有200个核苷酸。与原核mrna相似。真核mrna5端不翻译区中常有一段顺序与核糖体小亚基上的18srrna的3端的一段顺序互补并结合，这种结合与真核mrna的翻译启动有关。

    翻译区(编码区)使用的密码子除线粒体(如人牛和酵母线粒体)外与原核生物mrna是一样的。真核生物mrna的起始密码子都是aug。真核和原核生物mrna使用的密码子也都有‘简并现象‘。即几种不同的密码子翻译出同一种氨基酸，但不同的mrna中简并密码子的利用率是不同的，真核与原核生物之间的差别就更大。mrna的终止密码子有3个(uaguga和uaa)，其功能是停止翻译，一般只用一个终止密码子就能使翻译停止。有的mrna有2个连续的终止密码子(见)。

    3端不翻译区的长短在不同的mrna上有所不同，β珠蛋白mrna只有39个核苷酸，而卵白蛋白mrna则有637个核苷酸。真核生物mrna3端不翻译区常有aauaa(a)或auuua(a)等顺序，它们和识别多聚a聚合酶及装配多聚a尾巴有关。除个别组蛋白mrna外。真核生物mrna3端均有多聚a尾巴3端多聚a尾巴的长度随来源不同而不同，且随mrna的老化而变短，通常有20~200个a多聚a与mrna稳定性及mrna从细胞核转到细胞浆中有关。

    多顺反子描述的是一个新型的表达系统，用以从一个单一多顺反子构建体中产生目的多基因产物。尤其是，该表达系统包含一个多顺反子载体，能够在真核宿主细胞中表达功能抗体，其中载体在5′-3′方向上至少包含下面的可cao作连接的元件:在真核细胞可cao作的启动子;编码至少抗体轻链可变区的dna序列;内部核糖体进入位点(ires);以及至少一个编码抗体重链的dna序列。也公开了包含多顺反子表达载体的哺乳动物细胞，和一种在用多顺反子表达载体转染的哺乳动物细胞中产生功能抗体的方法。

    而最后一步，则是在里面找到报告基因。

    报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说。是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达。从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

    在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种:胭脂碱合成酶基因(nos)章鱼碱合成酶基因(ocs)新霉素磷酸转移酶基因(npt2)氯霉素乙酰转移酶基因(cat)庆大霉素转移酶基因葡萄糖苷酶基因荧光酶基因等。nosocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(s)的ti质粒特有的，对ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳。染色后在紫外光下观察荧光即可。npt2cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因。相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用。使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。常用的一种报告基因是β-d-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-d-葡萄糖苷酸。它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱荧光等进行检测。荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cdna文库中克隆出来的。该酶在有atpmg2 o2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用x-光片或专门仪器进行检测。

    在动物基因表达调控的研究中。报告基因也被广泛应用。常用的有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)β-半乳糖苷酶基因(lacz)二氢叶酸还原酶基因荧光酶基因等。cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快灵敏度比cat基因高30~1000倍费用低不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。

    可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。双杂交体系是由报告基因转录调控区报告基因及一对可以相互作用的杂合反式作用因子组成。来从上述杂交体系中发展出的单一杂交体系技术，也是根据报告基因表达量的检测筛选出与已知顺式作用元件相结合的未知因子的dna，该项技术正广泛应用于克隆细胞中含量微弱且用生化手段难以纯化的反式作用因子。

    由此可知，报告基因在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位。它是作为外源目的基因能否转化植物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，现已推广到真核生物的基因调控领域中。随着基因工程技术日新月异的发展，报告基因这一探路者的作用会更明显。

    最常用的报告基因大多是编码抗生素抗性蛋白的基因，通过检查产物是否具有抗生素的抗性来确定基因的表达情况。

    氯霉素乙酰基转移酶(cat):该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰coa的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。cat在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素荧光素和酶联免疫吸附测定检测其活性。也可进行蛋白质印迹)和免疫组织化学分析。cat与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。

    β半乳糖苷酶:β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacz基因编码。可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。以邻-硝基苯-β-d-半乳吡喃糖苷(onpg)为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红-β-d-半乳吡喃糖苷(cprg)是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比onpg高近10倍。以mug和荧光素二半乳糖苷(fdg)为底物则可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(facs)分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。

    荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶。哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶萤火虫荧光素酶和renilla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高。检测线性范围宽达7~8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因。用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性。renilla荧光素酶催化肠腔素氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。自1986年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应用ga公司的pgl3及pgl2系列载体，含sv40启动子及增强子的不同组合，有助于分析dna片段的转录活性。

    “主人，成功了！”

    不知道过了多久，墨莲人恭敬地对李安道。

    李安满意地看着自己的身体，然后进入了这个躯体之中！(未完待续)